掃描電鏡制樣方法｜5種常用的生物樣品干燥方法

掃描電鏡在觀察生物樣品時(shí)，具有以下特點(diǎn)：多角度觀察樣品的表面結(jié)構(gòu)；不需要將樣品切成薄片；景深大、圖像立體感強(qiáng)；放大倍數(shù)從幾十倍到幾十萬(wàn)倍連續(xù)可調(diào)；在觀察形貌的同時(shí)可以對(duì)微區(qū)的成分進(jìn)行定量和定性分析。而能否獲得真實(shí)、清晰、理想的掃描電鏡觀察結(jié)果，樣品的制備過(guò)程是關(guān)鍵。

生物樣品含水直接觀察，會(huì)對(duì)掃描電鏡造成以下影響：

1.  樣品蒸發(fā)的水蒸氣遭遇高能電子束，會(huì)被電離而放電，引起束流大幅度波動(dòng)，使圖像模糊，或者根本不能成像;

2.  大多數(shù)含水樣品在高真空中容易發(fā)生形態(tài)損傷，表面皺縮、變形; 

3.  樣品揮發(fā)會(huì)造成鏡頭、光闌等的污染; 

4.  燈絲會(huì)被上升水蒸氣氧化而變質(zhì)。

生物樣品的含水量高，二次電子產(chǎn)率低，導(dǎo)電性差，對(duì)熱，電子束敏感，僅有少數(shù)樣品如毛發(fā)、牙齒以及含水量極低的昆蟲(chóng)等可以直接噴鍍觀察，絕大多數(shù)的生物樣品均要求經(jīng)過(guò)干燥處理才能鍍金觀察。

干燥是掃描電鏡生物樣品制備中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如果處理不好，會(huì)直接影響到觀察的清晰度與準(zhǔn)確度。要想制備出好的掃描電鏡生物樣品，需要在干燥過(guò)程中盡可能減少由于水分蒸發(fā)而引起的樣品表面形貌的形變，且必須確保干燥。大多數(shù)動(dòng)植物容易發(fā)生明顯的塌陷和變形。因此，需要針對(duì)不同的生物樣品來(lái)選擇合適的干燥方法。

掃描電鏡生物樣品制備常用干燥方法

01  自然干燥法

自然干燥法是指樣品中的水分在大氣中自然蒸發(fā)，或樣品經(jīng)脫水處理后脫水劑自然揮發(fā)而干燥的方法。

對(duì)干種子、果殼、某些干花粉、昆蟲(chóng)標(biāo)本等來(lái)說(shuō)，自然干燥法是一個(gè)簡(jiǎn)易實(shí)用有效的方法，雖然在自然干燥過(guò)程中，樣品體積有所收縮，但卻保留了樣品的基本形態(tài)。適用于外表堅(jiān)硬的樣品，如外表有殼的昆蟲(chóng)，木材等。

自然風(fēng)干——飛納掃描電鏡直接觀察螨蟲(chóng)

02  烘干干燥法 

烘干干燥法是將要研究的樣品用烘干箱烘干，一般溫度控制在 80℃ 以下，烘干程度以含水量在 5% 以下為好。此方法的干燥速度較快，但水分蒸發(fā)時(shí)可能造成樣品變形或斷裂。適用于不易變形且耐熱的樣品，比如淀粉粒、孢子粉等。

烘干的花粉噴金后直接可以用二次電子觀察

03  臨界點(diǎn)干燥法

臨界點(diǎn)干燥法是利用物質(zhì)在臨界狀態(tài)下，液體和氣體的密度相等，氣液界面消失，液體的表面張力系數(shù)為零。臨界點(diǎn)干燥法之所以一直被視為制作生物醫(yī)學(xué)掃描樣品較可靠的干燥方法，是因?yàn)榇朔芟后w表面張力的作用，干燥出的樣品能較大程度地保存其自然形態(tài)。

04  冷凍干燥法

冷凍干燥法是將含水樣品放入低溫環(huán)境中冷凍，或使用溶劑將樣品中的水逐級(jí)替換后冷凍，然后抽真空升華。它是利用低溫和真空，使樣品中的水分或溶劑直接升華，以達(dá)到干燥樣品的目的。冷凍干燥過(guò)程不經(jīng)過(guò)液相階段，因而避免了氣相和液相之間表面張力對(duì)樣品的損傷。

05  真空干燥法

真空干燥法指的是將經(jīng)脫水（多用梯度脫水）的樣品置于真空容器中進(jìn)行干燥的方法。真空干燥法選用高熔點(diǎn)的有機(jī)溶劑（叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷、正丁醇等）作升華介質(zhì)，既保留了冷凍干燥法的優(yōu)點(diǎn)，又不用對(duì)樣品進(jìn)行冷凍處理，無(wú)冷凍損傷，且操作簡(jiǎn)單。適用于所有生物樣品，特別是細(xì)菌、細(xì)胞等微小樣品。

經(jīng)過(guò)梯度脫水真空干燥的桿菌可以輕松獲得高倍圖像

小結(jié)

干燥方法在不斷改進(jìn)，但還是只能把由干燥引起的樣品變形控制在一定的范圍內(nèi)。上述 5 種干燥方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，且各有適用的生物樣品種類。我們?cè)谶x擇生物樣品干燥的方法時(shí)，盡量選擇能保持樣品表面真實(shí)結(jié)構(gòu)的方法，在保證掃描電鏡狀態(tài)下，盡量還原樣品表面細(xì)節(jié)。

對(duì)于生物樣品，飛納電鏡低真空模式可以直接觀察一些生物樣品，如新鮮植物葉片，昆蟲(chóng)等。觀察葉子氣孔，高亮度的 CeB6 燈絲可以在低曝光時(shí)間下快速拍照，獲得高質(zhì)量圖像，避免了長(zhǎng)時(shí)間曝光導(dǎo)致氣孔關(guān)閉以及長(zhǎng)時(shí)間抽真空導(dǎo)致葉片失水收縮。

飛納電鏡低真空下觀察葉子氣孔

此外，飛納電鏡的專用控溫樣品杯可以控制樣品溫度，進(jìn)而改變樣品周圍的濕度，最大限度地降低電子束和真空度對(duì)樣品的損壞。適用于一些含水較高的水凝膠，蛋白，藻類等樣品，在冷凍狀態(tài)下，不脫水，背散射直接觀察，可以保持樣品的原始形貌結(jié)構(gòu)。

冷凍的水凝膠，觀察到其大范圍內(nèi)，短程有序，長(zhǎng)程無(wú)序